36 trang
Bạn đang đọc: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật – Tài liệu, ebook, giáo trình, hướng dẫn
|
Chia sẻ: lylyngoc
| Lượt xem: 12753
| Lượt tải : 21
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
MỤC LỤC Bài 1. Phương pháp pha chế thiên nhiên và môi trường nuôi cấy mô thực vật 2 Bài 2. Phương pháp khử trùng mô thực vật 8 Bài 3. Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam 12 Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ 15 Bài 5. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật 20 Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống tự tạo 25 Bài 7. Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 30 Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật 34 Bài 9. Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 BÀI I PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC 1.1 – Nguyên tắc pha chế môi trường tự nhiên Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại thiên nhiên và môi trường nuôi cấy vi sinh là có thành phần rất phức tạp, sự hiện hữu của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các thiên nhiên và môi trường nuôi cấy ( thiên nhiên và môi trường thao tác ), người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường tự nhiên mà chuẩn bị sẵn sàng trước dưới dạng nhiều loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước vô khoáng khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ ( stock ). Dung dịch mẹ được dữ gìn và bảo vệ dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thông thường pha các dung dịch mẹ : stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh trưởng, và các stock thiết yếu khác. 1.2 – Phân loại thiên nhiên và môi trường nuôi cấy mô thực vật Tùy theo thành phần các chất có trong thiên nhiên và môi trường, hoàn toàn có thể phân thành 3 loại thiên nhiên và môi trường : – Môi trường nghèo chất dinh dưỡng : như môi trường tự nhiên White, Knop. Môi trường này thích hợp vào các quy trình tiến độ cuối của quá trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị sẵn sàng chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng hoàn toàn có thể sử dụng trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật. – Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình : môi trường tự nhiên B5, Gamborg. Loại thiên nhiên và môi trường này được sử dụng so với 1 số ít loại cây có nhu yếu các chất dinh dưỡng trong môi trường tự nhiên vừa phải hoặc cũng hoàn toàn có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài ngày. – Môi trường giàu chất dinh dường : thiên nhiên và môi trường MS ( Murashige – Skoog ). Đây là thiên nhiên và môi trường khởi đầu cho mọi quy trình nuôi cấy mô so với mọi đối tượng người dùng nuôi cấy. Môi trường MS là một môi trường tự nhiên thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân đối về chất dinh dưỡng. 2 – NGUYÊN LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 – Hoá chất – Saccharose ( sucrose ) – Agar – NH4NO3 – KNO3 – MgSO4. 7H2 O – KH2PO4 – CaCl2. 5H2 O – KI – Na2MoO4. 2H2 O – CoCl2. 6H2 O – H3PO3 – MnSO4. 4H2 O – ZnSO4. 7H2 O – CuSO4. 5H2 O – Thiamine HCl – Myo-inositol – Glycine – NAA – BA ( 6 – Benzyl aminopurin ) – Na2-Ethylen diamin tetraacetat ( Na2 EDTA – Fe2 ( SO4 ) 3 2.2 – Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm ( 30 sinh viên ) thực hành thực tế STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 – Bình định mức : 100 ml cái 10 2 – Bình định mức : 500 ml cái 3 3 – Ống đong : 100 ml cái 12 4 – Ống đong 500 ml cái 3 5 – Đũa khuấy cái 15 6 – Bình màu 200 ml cái 5 7 – Quả bóp cao su đặc cái 15 8 – Bể ổn nhiệt cái 1 Dùng để pha Fe-EDTA 9 – Cốc 100 ml cái 30 10 – Cốc 200 ml cái 15 11 – Pipett : 1 ml cái 15 12 – Pipett : 5 ml cái 15 13 – Pipett : 10 ml cái 15 14 – Bình định mức 250 ml cái 15 15 – Ống nghiệm Þ 25 ống 100 16 – Bông mỡ g 200 17 – Bình màu : 1000 ml cái 2 Bảo quản các stock 3 – NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh chia nhóm thực hành thực tế pha chế các dung dịch mẹ ( stock ) của môi trường tự nhiên MS ( Murashige – Skoog ) như sau : dung dịch mẹ khoáng đa lượng ( Skoog I ), dung dịch mẹ Fe – EDTA ( Skoog II ), dung dịch mẹ khoáng vi lượng ( Skoog III ), dung dịch mẹ chất điều hoà sinh trưởng 4 – THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ ( Stock ) MÔI TRƯỜNG MS ( Murashige – Skoog ) 4.1. Pha stock khoáng đa lượng thiên nhiên và môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần ( x20 ) Cân đúng mực bằng cân nghiên cứu và phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong khoảng chừng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào theo trình tự nhất định sau : Tên hoá chất Nồng độ thiên nhiên và môi trường nuôi cấy ( mg / lít ) Nồng độ dung dịch stock ( x20 ) ( mg / lít ) – MgSO4. 7H2 O 370 7.400 – KH2PO4 170 3.400 – KNO3 1.900 38.000 – NH4NO3 1.650 33.000 – CaCl2. 2H2 O 440 8.800 Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan trọn vẹn và bổ trợ thêm 100 ml nước cất hai lần trước khi bổ trợ các khoáng khác vào ( giải pháp pha thể tích tăng dần ). Do CaCl2. 2H2 O hoàn toàn có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4. 7H2 O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2. 2H2 O vào sau cuối. Cho tổng thể vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000 ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10 oC, dùng 50 ml cho một 1000 ml thiên nhiên và môi trường nuôi cấy. 4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần ( x1000 ) Do hàm lượng một số ít loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất nhỏ, khó hoàn toàn có thể cân đong đúng chuẩn như 1 số ít các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây, ta phải thực thi pha riêng dung dịch các khoáng này ( CuSO4. 5H2 O, CoCl2. 6H2 O ) có nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “ bà ngoại ”. Sau khi pha tuy nhiên các dung dịch “ bà ngoại ”, thực thi pha 100 ml stock khoáng vi lượng X1000 tương tự như như ở phần trên. Thành phần các khoáng như sau : Tên hoá chất Nồng độ thiên nhiên và môi trường nuôi cấy ( mg / lít ) Nồng độ dung dịch stock ( x1000 ) ( mg / lít ) Nồng độ dung dịch “ bà ngoại “ ( x100 ) ( mg / lít ) H3PO3 6,2 6200 MnSO4. 4H2 O 22,3 22300 ZnSO4. 4H2 O 8,6 8600 Na2MoO4. 2H2 O 0,25 250 KI 0,83 830 CuSO4. 5H2 O 0,025 25 2500 CoCl2. 6H2 O 0,025 25 2500 4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần ( x200 ) Sắt là yếu tố rất thiết yếu cho thực vật. Tuy nhiên, nhu yếu của thực vật so với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung ứng đủ lượng sắt cho thực vật ta thường dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm Fe của EDTA dưới công dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng thích ra thiên nhiên và môi trường tuỳ theo nhu yếu của thực vật. Phương pháp pha như sau : Tên hoá chất Nồng độ môi trường tự nhiên nuôi cấy ( mg / lít ) Nồng độ dung dịch stock ( x200 ) ( mg / lít ) FeSO4. 7H2 O 27,8 5560 Na2 EDTA 37,3 7460 Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng chừng 80 oC. Cân đúng chuẩn 5,56 g FeSO4. 7H2 O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan trọn vẹn. Cân đúng mực 7,46 g Na2 EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan trọn vẹn. Cho từ từ dung dịch FeSO4. 7H2 O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừa khuấy đều. Cuối cùng bổ trợ nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10 oC, dùng 5 ml cho một 1000 ml môi trường tự nhiên nuôi cấy. 4.4. Pha stock hormon Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau. IAA, NAA, BA pha trong NaOH 1N ( thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm nước đến thể tích cần ). GA3, 2,4 – D pha trong cồn 50 o cho đủ thể tích. Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau : + Cách 1 : pha theo hệ mol Ví dụ : Pha 100 ml dung dịch stock IAA ( M = 176,19 ) có nồng độ 1 mmol ( milimol ) từ IAA tinh khiết. 176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước ® 1000 ml dung dịch có nồng độ 1 mol / lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol / lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có 100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol / lít cần 0,017619 g IAA. ( MNAA : 186,2 ; M2, 4 – D : 221,04 ; MBA : 225,2 ) + Cách 2 : pha theo hệ mg / lít : làm tựa như như cách pha khoáng. Các dung dịch stock hormon sau khi pha tuy nhiên được dữ gìn và bảo vệ trong các chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10 oC. 4.5. Pha stock vitamin môi trường tự nhiên MS nồng độ đậm đặc 500 lần ( x500 ) Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ sung các vitamin vào theo trình tự sau : Tên hoá chất Nồng độ môi trường tự nhiên nuôi cấy ( mg / lít ) Nồng độ dung dịch stock ( x500 ) ( mg / lít ) Acid nicotinic 0,5 250 Thiamin HCl 0,1 50 Pyridoxin HCl 0,5 250 Myo-inositol 100 50.000 Glycine 2 1.000 Cho toàn bộ dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ trợ cho đủ 100 ml. Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0 oC, dùng 2 ml cho một 1000 ml môi trường tự nhiên nuôi cấy. 4.6. Pha môi trường tự nhiên thao tác ( môi trường tự nhiên nuôi cấy ) Pha 1 lít môi trường tự nhiên MS cơ bản : – Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher. – Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan trọn vẹn – Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều. – Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều. – Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều. – Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500. – Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục tiêu nuôi cấy. – Chuyển tổng thể dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml – Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH = 5,8. – Bổ sung 6-8 g agar. – Đun sôi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp thiên nhiên và môi trường vào các bình nuôi cấy, cần chia xong trước khi dung dịch môi trường tự nhiên MS nguội xuống 50 oC. Hấp khử trùng ( so với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ trợ vào môi trường tự nhiên sau khi hấp ). Môi trường sau khi hấp được dữ gìn và bảo vệ ở 25 oC. 5 – BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III. 2. Quan sát hiện tượng kỳ lạ phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích. 3. Từ BA tinh khiết, trình diễn cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol / lít. Biết MBA = 225,2. 4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 mmol / lít để pha môi trường tự nhiên thao tác có nồng độ IAA là 0,1 mmol / lít. BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔ THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC Một thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật khác với một thí nghiệm nuôi cấy vi sinh thường thực thi trong một thời hạn rất vĩnh viễn. Với một thí nghiệm trường diễn như vậy, chỉ cần một tế bào vi trùng, một bào tử nấm mốc rơi vào môi trường tự nhiên nuôi cấy, sau một thời hạn ngắn sẽ sinh sôi làm hỏng môi trường tự nhiên, làm hỏng thí nghiệm và phải thực thi làm lại từ đầu. Do đó việc vô trùng tức vô hiệu hết nấm khuẩn trong nuôi cấy mô thực vật vô cùng quan trọng. Mô cấy hoàn toàn có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ … tùy theo sự tiếp xúc với thiên nhiên và môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi trùng và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên tự nhiên vào thiên nhiên và môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua tiến trình khử trùng để vô hiệu hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên quy trình này phải bảo vệ là mô thực vật còn sống, có năng lực tăng trưởng, tăng trưởng tốt. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất lúc bấy giờ là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào vào thời hạn giải quyết và xử lý, nồng độ và năng lực xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên mặt phẳng mô cấy, năng lực đẩy hết các bọt khí bám trên mặt phẳng mô cấy. Để tăng tính linh động và năng lực xâm nhập của chất diệt khuẩn, thường thì người ta lắc mô cấy với cồn 70 %, sau đó mới giải quyết và xử lý dung dịch diệt khuẩn. Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật Tác nhân vô trùng Nồng độ ( % ) Thời gian giải quyết và xử lý ( phút ) Hiệu quả Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypoclorid 2 5 – 30 Rất tốt Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 30 – 60 Khá tốt Trong thời hạn giải quyết và xử lý, mô cấy phải ngập trọn vẹn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi giải quyết và xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi giải quyết và xử lý tuy nhiên, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng ( tối thiểu là 3 lần ). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mô cấy lên mô trường. Để tránh tác động ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý quan tâm để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp sau cuối này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên thiên nhiên và môi trường. Như vậy, để hoàn toàn có thể đạt được mục tiêu khử trùng ( vô hiệu hết mầm vi sinh vật, mô thực vật hoàn toàn có thể tăng trưởng, tăng trưởng ), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố tương quan ngặt nghèo với nhau và tương quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là : – Chất khử trùng – Nồng độ chất khử trùng – Thời gian khử trùng. Vô trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành công xuất sắc ngay lần tiên phong. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm nồng độ và thời hạn vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc như đinh sẽ đạt tác dụng. 2 – VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 – Vật liệu – Cây Trầu bà – Hạt thuốc lá 2.2 – Hoá chất – Xà phòng bột – Cồn 70 o, 90 o – Javel – Ca ( OCl ) 2 ( Caxi hypoclorid ) 2.3 – Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm ( 30 sinh viên ) thực hành thực tế STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 – Dao mổ cái 15 2 – Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 – Ống đong : 100 ml cái 12 4 – Ống đong 500 ml cái 3 5 – Đũa khuấy cái 15 6 – Cốc 500 ml cái 15 7 – Quả bóp cao su đặc cái 15 8 – Cốc 1000 ml cái 5 9 – Cốc 100 ml cái 30 10 – Cốc 200 ml cái 15 11 – Pipett : 1 ml cái 5 12 – Pipett : 5 ml cái 5 13 – Pipett : 10 ml cái 5 14 – Erlen 250 ml cái 60 15 – Kẹp dài 25 cm Cái 15 16 – Bông mỡ g 200 17 – Ống nghiệm Þ25 cái 15 18 – Tủ cấy vô trùng cái 1 Tủ cấy có quạt thổi vô trùng 3 – NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh thực hành khử trùng đốt thân cây Trầu bà, hạt thuốc lá. Sau khi vô trùng thực thi gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên môi trường tự nhiên MS. 4 – THỰC HÀNH 4.1 – Khử trùng cây Trầu bà a. Thực hiện trong phòng thí nghiệm – Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30 cm. Rửa các đoạn này dưới vòi nước máy cho sạch bụi đất. – Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng chừng 3 cm, mỗi đốt mang một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ. – Rửa các đốt với nước có pha một chút ít xà phòng trong các erlen. – Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng. b. Thực hiện trong tủ cấy – Lắc các đốt thân với cồn 70 o trong 1 phút – Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10 % trong 10 phút ( hay dung dịch javel được pha loãng với tỷ suất 1 : 9 trong 5 phút ). – Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần – Gạn bỏ nước. 4.2 – Khử trùng hạt thuốc lá – Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy. – Lắc hạt với nước có pha một chút ít xà phòng. – Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng – Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70 o trong 1 phút. – Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10 % trong 5 phút. – Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. – Gạn bỏ nước. 4.3 – Cách cấy mẫu a. Mẫu cây Trầu bà – Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy vô trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá. – Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích cỡ khoảng chừng 1×1 cm cấy vào môi trường tự nhiên MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm. – Khi cấy mẫu cần chú ý quan tâm cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm được đặt trong phòng lạnh nhiệt độ 25 oC, cường độ ánh sáng 2500 – 3000 lux. b. Mẫu hạt thuốc lá – Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên mặt phẳng thiên nhiên và môi trường MS trong các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1 cm. – Các erlen được đặt ở nơi tối trọn vẹn. 5 – BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày giải pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá. 2. Vai trò và tính năng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid. 3. Ghi nhận tác dụng nuôi cấy. BÀI 3 KHỬ TRÙNG, NUÔI CẤY CHỒI NGỦ CÚC HẠT CAM 1 – NGUYÊN TẮC Trong các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây xanh, bên cạnh những giải pháp yên cầu người thao tác phải có kỹ thuật cao như tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, vi ghép …, chiêu thức nhân giống bằng nuôi cấy chồi ngủ ( chồi nách ) là chiêu thức đơn thuần, dễ thực thi và mang lại hiệu suất cao cao nhất. Ở hầu hết các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này có đặc tính trọn vẹn giống với các đỉnh sinh trưởng ( là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái tiềm sinh ), có năng lực tăng trưởng tăng trưởng thành một khung hình thực vật toàn vẹn. Các chồi ngủ này đa phần bị ức chế sự tăng trưởng bởi các chồi đỉnh ( tính lợi thế ngọn ). Nếu tách riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi khung hình thực vật, dưới ảnh hưởng tác động bởi những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách này hoàn toàn có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới ( từ hàng chục tới hàng trăm chồi ). Với những chồi mới tạo thành, liên tục cấy chuyền sang những thiên nhiên và môi trường tạo chồi mới thì thông số nhân giống rất đáng kể. Với những loài thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ ( đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị ) thì việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó triển khai. Vì vậy, với những loại thực vật này, phương pháp nhân giống vô tính hiệu suất cao nhất là nuôi cấy chồi nách. Chồi nách đem nuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu suất cao tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn so với chiêu thức nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Việc tách chồi nách thường triển khai với những đoạn nhánh có mang chồi của thực vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng hoàn toàn có thể thực thi từ những cây vô trùng trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống. Trong bài thực hành thực tế này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua nuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho giải pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống. 2 – VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 – Vật liệu – Cây hoa cúc – Hạt cam 2.2 – Hoá chất – Cồn 70 o, 90 o – Môi trường MS bổ trợ 2,4 – D – Xà phòng bột – Cồn 70 o, 90 o – Javel – NAA – BA 2.3 – Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm ( 30 sinh viên ) thực hành thực tế STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 – Dao mổ cái 15 2 – Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn 3 – Ống đong : 100 ml cái 12 4 – Ống đong 500 ml cái 3 5 – Đũa khuấy cái 15 6 – Cốc 500 ml cái 15 7 – Quả bóp cao su đặc cái 15 8 – Cốc 1000 ml cái 5 9 – Cốc 100 ml cái 30 10 – Cốc 200 ml cái 15 11 – Pipett : 1 ml cái 5 12 – Pipett : 5 ml cái 5 13 – Pipett : 10 ml cái 5 14 – Erlen 250 ml cái 60 15 – Kẹp dài 25 cm Cái 15 16 – Bông mỡ g 200 17 – Ống nghiệm Þ25 cái 15 18 – Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15 19 – Đèn cồn cái 15 20 – Tủ cấy vô trùng cái 1 Tủ cấy có quạt thổi khí vô trùng 3 – NỘI DUNG THỰC HÀNH – Sinh viên triển khai cắt đốt thân cúc, triển khai xác lập công thức khử trùng. Nuôi cấy thân cúc trên môi trường tự nhiên MS bổ trợ. – Sinh viên triển khai khử trùng, tách vỏ và nuôi cấy hạt cam trên môi trường tự nhiên MS. 4 – THỰC HÀNH 4.1 – Khử trùng và nuôi cấy thân cúc cắt đốt a. Khử trùng – Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một đoạn cách gốc 10 ¸ 15 cm. – Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy. – Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ. – Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 10 ¸ 15 phút. – Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy. – Lắc với cồn 70 o trong 1 phút. – Lắc với dung dịch javel / nước ở các tỷ suất 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1. – Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 5 ¸ 6 lần. b. Nuôi cấy – Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên thiên nhiên và môi trường MS bổ trợ BA và NAA với tỷ suất NAA / BA < 1. - Cắm thân cúc vào thiên nhiên và môi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên mặt phẳng thiên nhiên và môi trường. 4.2 - Khử trùng và nuôi cấy hạt cam a. Khử trùng hạt - Rửa hạt cam dưới vòi nước máy. - Lắc hạt với nước xà phòng 10 ¸ 15 phút. - Rửa sạch xà phòng bằng nước máy. - Lắc với cồn 70 o trong 30 giây. - Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 5 ¸ 6 lần. b. Tách vỏ hạt - Đặt hạt cam lên trên giấy cấy. Dùng kẹp giữ hạt. - Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dà
Source: http://amthuc247.net
Category: Cách pha
